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RAST
RICERCA IgE SPECIFICHE
E. Errigo, Malattie allergiche, Lombardo, Roma, 2000



L'impiego di test di laboratorio in vitro, con varie metodiche introdotte negli ultimi decenni, ha comporto certamente significativi progressi nella diagnostica delle sindromi allergiche IgE mediate.
Tra i vantaggi di questi test, globalmente considerati, vanno indicate soprattutto la sensibilità e la specificità notevolmente elevate, la buona riproducibilità, l'assolute innocuità per il paziente; gli svantaggi si riassumono, in pratica, nel costo relativamente elevato.
Va tuttavia sottolineato che, in particolare negli ultimi anni, si è abusato, in maniera del tutto irrazionale, di queste indagini, spesso inutilmente richieste ed a volte non adeguatamente eseguite o erroneamente interpretrate.
Allo stato attuale delle conoscenze, l'indagine in vitro che riveste un reale significato nella pratica clinica è rappresentata essenzialmente dalla ricerca di IgE specifiche verso uno o più allergeni, soprattutto con tecniche radioimmunologiche o immunoenzimatiche, mentre, come sarà esposto in seguito, la determinazione dei valori delle IgE seriche totali, appare di minore significato clinico. Altre indagini (ricerca di IgG specifiche e delle loro sottoclassi, caratterizzazone del profilo della reattività anticorpale specifica verso distinti determinanti antigenici di un allergene, dosaggi dei vari mediatori, etc.) sono state recentemente semplificate ed introdotte nella pratica clinica; altre ancora (valutazione della sintesi spontanea di IgE specifiche da colture linfocitarie, etc.), invece, rimangono appannaggio di pochi laboratori specializzati.

La dimostrazione di IgE specifiche sieriche verso un determinato allergene può consentire la diagnosi eziologia in vitro di una malattia allergica.
Numerosi immunoassay (radioimmunologici, immunoenzimatici, fluorimetrici, test di agglutinazione o di precipitazione), basati sull'impiego di differenti metodi ed immunoreagenti, sono stati proposti per la ricerca di IgE sieriche verso uno o più allergeni.

PRINCIPALI SISTEMI IMMUNOENZIMATICI DISPONIBILI IN ITALIA PER LA DETERMINAZIONE DELLE IgE SPECIFICHE
Metodiche basate sulla marcatura anti-IgE
Metodica
Allergeni a fase solida
Anticorpi anti-IgE marcati
Substrato
Lettura
Standardizzazione
ENEASYSTEM Adesi a una fase solida in PVC (ACE) Policlonali, coniugati con ureasi Urea Fotometrica Curve specifiche per famiglie di allergeni
UNICAP Adesi ad un derivato di cellulosa attivato con bromuro di cianogeno Mix di policlonali e monoclinali coniugati con b-galattosidasi Metil-umbelliferil-galattoside Fluorimetrica IgE totali
(WHO 75/502)
FAST Adesi a micropiastre Monoclinali, coniugati con fosfatasi alcalina Metil-umbelliferil-fosfato Fluorimetrica IgE totali
(WHO 75/502)
HI-TEC In fase solida, predispensati in tubi Fosfatasi alcalina Para-nitrofenilfosfato Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)
AlaSTAT In fase liquida Perossidasi Tretametilbenzidina Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)
CLAS In fase liquida Perossidasi Tretametilbenzidina Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)
Magic Lite SQ Adesi a particelle paramagnetiche Monoclonali, coniugati con estere acridinio   Luminometrica Curva di G6
ACCESS In fase liquida, adesi a particelle paramagnetiche Legati a fosfatasi alcalina Dioxetano Luminometrica IgE totali
(WHO 75/502)
MATRIX Pannelli prefissati di allergeni Coniugati con fosfatasi alcalina Bromo-cloro-indolil-fosfato Fotometrica Curva per ciascun allergene
Metodiche basate sulla marcatura dell'allergene
Metodica
Anti-IgE e fase solida
Allergeni marcati
Substrato
Lettura
Standardizzazione
Immulite Tubi con biglie coattate con anti-IgE In fase liquida, coniugati con fosfatasi alcalina Adamantil-dioxetano fosfato Luminometrica  
ALLERTECH Micropozzetti coattati con anti-IgE Allergeni in fase liquida biotinilati/streptavidina-perossidasi Tetrametilbenzidina Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)
CARLA Micropozzetti coattati con anti-IgE Allergeni in fase liquida biotinilati/streptavidina-perossidasi Tetrametilbenzidina Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)
REALTEST Micropozzetti coattati con anti-IgE Allergeni in fase liquida biotinilati/streptavidina-perossidasi Tetrametilbenzidina Fotometrica IgE totali
(WHO 75/502)


In pratica si possono distinguere fondamentalmente due tipi di metodiche:
1. Metodiche basate sulla marcatura di anti-IgE (metodi sandwich), con impiego di sistemi allergene-fase solida e con marcatura di anti-IgE con tecniche radioimmunologiche o immunoenzimatiche. Queste metodiche, che hanno avuto il loro sviluppo con il RAST, sono quelle ancora più largamente impiegate nella pratica clinica. E' da rilevare che con queste metodiche le IgE reagiscono come anticorpi (frammento Fab).
2. Metodiche basate sulla marcatura dell'allergene (antigen binding assays), con impiego di anti-IgE su fase solida, cui si legano le IgE, totali e specifiche. Le prime metodiche (PTRIA, radioimmunodiffusione, etc.), risultavano notevolmente indaginose, per cui per lungo tempo sono state utilizzate quasi esclusivamente a fini di ricerca. Negli ultimi anni sono state, però, introdotte alcune metodiche "a cattura", che prevedono l'uso di micropiastre cui sono legate le anti-IgE.
Per quanto riguarda i test radioimmunologici, il RAST (RadioAllergoSorbent Test) ha rappresentato la prima metodica introdotta in campo applicativo.
La tecnica consiste nel porre il siero del paziente in esame a contatto con un allergene coniugato con legame di covalenza ad una fase solida (disco di carta o di polimero insolubile, microsfere, etc.); se il siero contiene IgE specifiche verso quel determinato allergene, esse si legano all'allergene stesso.




Dopo un lavaggio (per asportare altre IgE sieriche, non specifiche per quell'allergene), vengono aggiunti anticorpi anti-IgE marcati con I125 che si fissano alle IgE specifiche eventualmente presenti, a loro volta fissati all'allergene. Si viene così a formare un complesso fase solida-allergene-IgE specifiche-anticorpi anti-IgE marcati. Si misura la radioattività del complesso con un gamma-counter: maggiore è la radioattività, maggiore è la quantità di IgE specifiche che si trova nel campione in esame. Numerosi sistemi sono stati immessi in commercio (Phadebas RAST, Riallergy Specific E, CAP, etc.).
In seguito sono state introdotte nella pratica e si sono rapidamente affermate numerose metodiche immunoenzimatiche (ELISA e varianti) per la determinazione di IgE specifiche, fondamentalmente analoghe nei principi generali a quelle radioimmunologiche, ma con enzimi quali marcatori in alternativa ai radioisotopi.
I vantaggi di queste metodiche sono soprattutto di ordine pratico: i coniugati risultano stabili e possono essere conservati per lungo tempo; le procedure tecniche sono del tutto esenti da rischi per il personale che le applica; il materiale necessario può anche essere limitato ad apparecchiature abbastanza economiche; essendo peraltro possibile il ricorso a strumentazioni di alta precisione e automatizzate. La sensibilità, la specificità, e la riproducibilità delle metodiche immunoenzimatiche appaiono sovrapponibili a quelle delle metodiche radioimmunologiche. A parità di fase solida o liquida e di qualità dell'antisiero, si osserva infatti un'ottima concordanza tra test radioimmunologici ed immunoenzimatici; questa concordanza diminuisce, soprattutto nei casi con positività borderline, quando si effettuino comparazioni tra tecniche radioimmunologiche ed immunoenzimatiche con kit di ditte produttrici diverse, in ragione delle differenze esistenti nella qualità degli allergeni-fase solida e degli antisieri.
I sistemi immunoenzimatici attualmente disponibili per la determinazione delle IgE specifiche presentano numerose differenze:
· Marcatura di anti-IgE (sistemi sandwich) o dell'allergene (sistemi a cattura)


· Allergeni in fase solida o in fase liquida
· Differenti caratteristiche del supporto cui sono adesi gli allergeni (PVC, cellulosa, dischi di carta, biglie, sfere di polistirene, pozzetti di micropiastre, etc.).
· Differenti modalità di attivazione del supporto (coattazione passiva, bromuro di cianogeno, etc.).
· Differenti antisieri (anticorpi monoclinali o policlonali anti-IgE)
· Differenti enzimi coniugati alle IgE o agli anticorpi anti-IgE (ureasi, b-galattosidasi, fosfatasi alcalina, per ossidasi, etc.).
· Differente substrato (urea, etc.).
· Differente indicatore dell'avvenuta reazione porpora di bromocresolo per una lettura fotocolorimetrica o adamantil-dioxetano fosfato per una lettura in chemiluminescenza).
· Differente modalità di lettura dei risultati (fotocolorimetria o chemiluminescenza).

Senza entrare nei dettagli, deve essere sottolineato che, più che la tipo di test o di marcatore, la sensibilità e la specificità delle varie metodiche risultano legate alla qualità della fase solida o liquida, dell'allergene e dell'antisiero utilizzati.
Sia per i test radioimmunologici che per quelli immunoenzimatici è necessario eseguire confronti con preparazioni standard di controllo contenenti IgE specifiche per quel determinato allergene in concentrazioni diverse.
Mediante il confronto con queste preparazioni standard di controllo è possibile effettuare, entro certi limiti, una valutazione quantitativa delle IgE specifiche (in kU/l o in UI/ml) presenti nel siero del paziente in esame verso un determinato allergene, cioè stabilire classi di positività per ciascun allergene.
La classe 0 è negativa (cioè nel campione in esame non sono svelabili anticorpi specifici verso quell'allergene), la classe 1 è da considerare molto dubbia, mentre le classi comprese tra 2 e 6 sono da considerare positive (tanto più alta è la classe, tanto più alto è il livello di IgE specifiche per un determinato allergene).
Analogamente a quanto segnalato per i test cutanei deve essere ricordato che non sempre la determinazione quantitativa delle IgE specifiche è correlata al grado della sensibilizzazione e, tanto meno, alla gravità della sindrome clinica. Infatti, si possono osservare allergopatie gravi con una modesta positività di IgE specifiche (ad esempio classe 2) e, viceversa, sindromi clinicamente lievi con intensa positività ai test sierologici specifici (ad esempio classe 3 o 4).